微滴式数字PCR系统与普通PCR技术的区别

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。 

PCR技术自问世以来，在遗传病、病原体、癌基因等分子诊断领域和法医鉴定等方面发挥了巨大作用。按照PCR技术的演进，人们习惯性将PCR技术划分为三代：普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。以前也介绍了很多关于qPCR相关知识，这期给大家分享另外两种PCR技术——普通PCR技术和dPCR技术，以期让大家对这些技术有更进一步的认识。

普通PCR

1、什么是PCR

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DN 片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

2、PCR基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。该技术是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经「高温变性—低温退火 — 引物延伸」三步反应的多次循环，使 DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

3、PCR反应要素

①DNA模版：可以是双链、单链、提取染色体的DNA、克隆的质粒DNA；②引物：一对寡聚DNA，分别与模板两侧的3’端序列互补，可使DNA序列得到扩增；③DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成；④缓冲液：提供DNA合成反应所需的PH,离子强度等环境；⑤4种单核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料。

4、普通PCR的优缺点

优点：经典方法，国际和国内标准齐全；仪器试剂成本较低、PCR产物可以回收后做其他分子生物学实验。

缺点：容易污染、操作繁琐、只能定性分析、敏感性中等、存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分。

5、应用范围

PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，最 大 特点是能将微量的 DNA 大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，只要能分离出一点 DNA，就能用 PCR 加以放大，进行比对。

微滴式数字PCR系统

1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了数字PCR的概念。dPCR是一种核酸分子绝 对 定量技术。相较于qPCR，dPCR对结果的判定不依赖于扩增曲线循环Ct值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA的分子个数，能够对起始样本核酸分子绝 对定量。分割单元数、荧光通道数、操作复杂性以及污染风险是评价数字PCR平台的重要指标。此外，使用多个数字PCR平台互相验证和使用定值准确的标准物质是评估数字PCR平台的主要方法。

1、什么是dPCR

dPCR：digital PCR（数字PCR），是一种基于泊松分布原理建立的核酸分子绝 对定量技术。通过将待测样本进行极限稀释，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行PCR扩增，可以检测到低至一个拷贝的突变。

2、微滴式数字PCR系统的基本原理

目前dPCR主要有两种形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

可以使用几种不同的方法来分配样品，包括微孔板、毛细管、油乳剂和带有核酸结合表面的小型化腔室阵列。样品的分配使人们可以通过假设分子种群遵循泊松分布来估计不同分子的数量，根据泊松分布的原理，反应体系中目标分子的拷贝数可以通过公式A=-ln[(N-X)/N]*N计算，从而解决了多个目标分子存在于单个液滴中的可能性。

3、微滴式数字PCR系统的优缺点

优点：实现绝 对定量、更高的敏感性和特异性、可以检测低拷贝样品、操作过程和结果分析简单。

缺点：仪器设备和试剂昂贵、操作复杂，检测时间长、成本较高、检测范围较窄，此方法适宜于对ctDNA或者其他低浓度样本的低频突变进行检测，特别适用于“液体活检”。

4、主要用途

基因表达：可对细微变化进行检测，准确性高，重复性佳。突变检测：可检测低含量的突变基因，突变序列检测灵敏度高。拷贝数变异CNV检测：可通过精确计量目的基因与参考基因，计算比值得到目的基因的拷贝数。二代测序数据验证：可直接对二代测序数据结果进行绝 对定量分析。

5、与常规PCR方法相比，数字PCR的优势

①可以实现绝 对定量：常规PCR定量需要制定已知拷贝数的标准DNA曲线，但是由于待检样本与标准曲线不在统一体系，条件上会存在差异，另外加上PCR扩增效率的差异从而影响定量结果的准确性。而数字PCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可进行绝 对定量。②样本需求量低：适用于珍贵样本或核酸降解严重的样本。③灵敏度高：数字PCR是将传统PCR反应体系分割成数万个独立PCR反应，这些反应可以精确地检测很小的目的片段差异、单拷贝甚至低浓度的混杂样本。且能避免非同源异质双链的形成。④高耐受性：由于目的序列被分配到多个独立反应体系中，显著降低了背景信号和抑 制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。

技术的进步给PCR技术不断地注入新的活力，使核酸检测更方便、更准确。目前三代PCR技术各有其优缺点，也各有不同的应用领域，不具有一代取代另一代的关系，科研工作者可根据自己的实际情况选择适合的PCR技术！