微滴式数字PCR系统荧光检测方法

微滴式数字PCR系统的荧光检测主流方法主要有两种,一种是以QuantStudio 3D数字PCR系统为代表的微流控芯片加工法,另一种则是Bio-rad QX200为代表的微滴法。这两个产品也是目前国内

三级医院数字PCR的主流产品。

QuantStudio 3D数字PCR系统基于高密度的微流控芯片, 将样品均匀分布到多达20000个微孔中相互隔离。PCR反应后,通过高亮度LED光源激发荧光信号, 使用冷CCD进行检测，再读取每个微孔的信号进行计数。

Bio-rad QX200则是借助了微滴技术和微流体技术,借助微滴发生器生成20000个均一的微滴，PCR后再将液滴吸入管路依次通过一个双色光学检测系统,再检测阳性和阴性的微滴数量

一种典型的流式装置光路布局:布置在侧面的激发光源产生的激发光,经二色镜反射，并聚焦到微液滴流道上,微液滴在流道中依次排列-一个个地通过聚焦位置,每个微液滴依次被照射产生激发荧光。荧光在被布置在下方的探测器收集,经过光电器件转变为易于处理和分析的电信号。

事实上，QuantStudio 3D之流的荧光成像法有几个优点。

首先,可以高通量地检测到带有荧光信号的液滴,在一张图像 中可以同时检测到数千个液滴。通过独特的广角镜头,甚至可以同时检测到100万个液滴。

其次，光学系统的设计相对简单明了，甚至传统的数码 单反相机都可以用来进行荧光成像。

第三,通过在多路检测中添加多个荧光滤光片,可以方便地实现多色荧光成像。

然而,于光源的稳定性变化和相邻液滴间的荧光信号干扰,使得荧光成像的检测灵敏度和动态范围受到限制。

Bio-rad采用的激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, LIF)细胞计数法，在LIF中,液滴经过流式光路检测,以每秒数百至数千液滴的速度检测荧光信号。并且LIF检测可以加上光学共焦检测模块,入射激光和发出的荧光信号分别通过针孔,通过抑 制非焦平面的光学噪声来提高信噪比。

LIF流式检测可以获得更高的灵敏度和动态范围。然而,与荧光成像系统相比, LIF光学系统的设计相对复杂。不过对于临床应用来说,高灵敏度的荧光检测对于ddPCR获得可靠、准确的患者标本诊断结果至关重要。