微滴式数字PCR系统简介

微滴式数字PCR系统是一种基于PCR反应的单分子绝 对定量技术。原理是将含有核酸模板的标准PCR反应体系,平均分配为数以万计的微液滴,尽可能使得每个反应中含有一一个模板 ,然后进行单分子模板的PCR反应。这样含有模板的液滴在扩增后就会具有较强的荧光,依次测量每一个微液滴读取荧光信号,再针对荧光信号的有无计数就可以实现绝 对定量。

微滴式数字PCR系统通过对样本的微滴化处理，大大提升了测量的灵敏度和准确性,只需要非常少的模板量就能够进行检测。此外, 微滴式数字PCR系统还弥补了系统需要严格依赖标准曲线的问题,测量绝 对定量,对逐个微液滴的统计分析结果可靠。在实际应用中, 微滴式数字PCR系统还具备防污染和全集成的优点。微滴式数字PCR系统反应被严格局限于水相微液滴中,能够有效避免接触污染，也易于集成和自动化。

数字PCR的检测灵敏度较荧光定量PCR高1-2个数量级,更适合检测微量痕量病毒,此次冠状病毒感染也出现了早期症状不明显,但是核酸检测呈阳性的的“潜在感染者”和"隐藏患者”。

微滴式数字PCR系统，PCR技术(聚合酶链式反应技术, polymerase chain reaction),是通过模拟体内的DNA复制方式,在体外有选择性地将特定基因(或DNA序列)扩增，使得样本中原本数量极少的特定基因数量变得足够庞大,从而能够被光学法或其他体外诊断方法检测出来。

微滴式数字PCR系统，PCR反应过程主要为三步:变性、退火和延伸。变性是通过加热:使DNA双链打开形成单链。然后退火降温，温度降低后加入的引物会与DNA中互补区相结合。最 后的延伸过程,在DNA聚合酶作用下,聚合酶催化引物延伸，合成出于DNA新链。以上的三个步骤为-一个循环,通过不断的循环半保留复制,一个DNA分子就会被复制成无数个同样的DNA分子。

以上步骤完成了特定基因的扩增,后续就是对扩增基因的检测。目前最为主流的检测方法是荧光光学法,荧光PCR (qPCR)是第二代PCR技术,就是在PCR反应过程中加入荧光基团,通过直接测量激发后的荧光光信号强弱,从而实时、定量地检测样本中的特定基因。荧光PCR因其简便、安全、非接触式的优点,得到了非常广泛的应用。然而荧光PCR也有自己的缺陷,其依赖标准曲线和参考样本、难以精确测定基因拷贝数、精确度也有不足的问题。这也是此次新冠疫情中,一些专家建议在核酸检测的同时,参考胸片CT影像综合诊断的原因。针对这些情况,能够绝对定量的第三代PCR技术一一微滴式数字PCR技术(DropletDigital PCR, DDPCR)显然具有更广阔的应用前景。