微滴式数字PCR系统操作程序

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。

下面我们一起来看看，微滴式数字PCR系统操作程序吧。

1.先打开电脑，再打开QX200 Droplet Reader电源，在使用前需预热至少30分钟; .

2.配制探针法定量反应体系，振荡混匀，离心除气泡，注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝较完整基因组DNA),如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul,可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度;

3.将一个新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口方向;

4.将20ul样品反应体系加入到DG8cartridge中间一-排的8个孔内，不足8个样品时用20ul1Xbuffercontrol补足，建议使用Rainin的8通道20ul排枪和20ul枪头(不能用200ul枪头)，加样时枪头接近孔一-侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第 一档位置 以免引入气泡;

5.在DG8 cartridge 最 底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(DG 0i)，同样不能有空着的孔;

6.盖上胶垫(gasket)， 注意两边的小孔都要钩牢;

7.将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成;

8.微滴生成于cartridge 最上面一排孔内， 建议使用Rainin 的8通道P-50排枪和200ul枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40ul， 将holder放平，枪头以与孔壁呈30~45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge和胶垫;

9.转移油滴进入96孔板内完成后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜(膜亮面朝上，暗面向下)，推荐的运行程序为: 180°C， 10s， 无需颠倒方向二次封膜;

10.封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4"C冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5°C/s。推荐反应条件:1. 95°C，10min;2.94C，30s 40循环Tm(退火温度按优化摸索得来的条件设置)，60s;3.98°C，10min;

11.查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常(不同说明书上稍有不同);

12.将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位。